细菌耐药影响Hp根除方案选择，治疗前如何判断？
幽门螺杆菌（Hp）在人群中的感染率高，我国近一半人口存在Hp感染，随着Hp耐药现象的日趋严重，其根除率正在逐年下降。在临床根治Hp方案中，克拉霉素是最常用的抗生素之一，最新报道指出Hp对克拉霉素的耐药率已达20%~50%。目前一致观点认为，Hp对克拉霉素的耐药机制主要是Hp 23SrRNA V区基因突变，从而导致克拉霉素与Hp结合力下降，无法阻止蛋白质的合成，其中A2142G和A2143G及A2142C为主要突变位点。多数文献已经证实，初次治疗失败将会导致再次治疗耐药率的升高，在初次治疗之前行耐药性检测会提高Hp根除率，且优于二线治疗及补救治疗。下面我们以克拉霉素为例，着重研究Hp耐药性检测方法，探讨快速、敏感的分子生物学新技术，从而有效指导临床用药。
传统检测方法
即先培养Hp菌株，再对其进行药物敏感试验（包括纸片扩散法、琼脂稀释法、E－test试验），此方法被认为是检测Hp对克拉霉素耐药性的“金标准”，但是，由于Hp在体外培养困难、培养周期长、费用昂贵、对操作技术要求高，且不能检测Hp耐药突变位点，故不适合开展临床检验诊断。
分子生物学检测方法
1.聚合酶链式反应－限制性片段长度分析技术（PCR－RFLP）：原理是利用PCR技术，对目的基因进行扩增，再利用特异性限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到的酶切产物行电泳迁移率变动分析，通过与标准基因电泳图谱对比，从而检测有无变异。该方法受到很多学者的青睐，他们研究发现突变位点A2142G、A2143G能分别产生BbsI（MboII）、BsaI酶切位点。该技术特异度和敏感度高，可用来检测Hp耐药。
2.实时荧光定量PCR（RT－PCR）：原理是在PCR扩增时同时加入引物和荧光集团，利用荧光信号对PCR扩增反应进行实时检测，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值（即扩增循环次数）和该模板的起始拷贝数存在线性关系，故可通过标准曲线对未知模板进行定性及定量分析。值得注意的是，该技术操作简单、专一、灵敏，较常规PCR具有更高的特异度和敏感度，除此之外，还可用于大量样本检测。
近年来，RT-PCR技术已经被广泛且成功的应用于不同实验室，其不仅可检测胃黏膜标本，还可以检测粪便标本Hp 23Sr RNA突变位点。RT-PCR技术检测粪便标本Hp 23SrRNA突变位点，具有取材方便、无创、经济、敏感等优点，但需要解决粪便中胆盐、重金属离子、多糖等物质对PCR的抑制，否则易出现假阴性结果。
3.PCR线性探针分析（LiPA）：原理是先用生物素来标记引物，然后利用PCR技术扩增目的基因序列，获得生物素化的扩增产物（即得到探针标记的待测核酸），再与固定在NC膜上未标记的特殊寡聚核苷酸探针杂交，最后经放射自显影手段就可以判定膜上是否有互补的核酸分子存在。此方法不但准确、灵敏，而且能同时检测多位点的突变，尤其存在多重耐药的情况下，其敏感度和特异度仍很高。但受探针的限制，目前该方法仅能检测到７种突变基因，相信随着技术的发展，在不久的将来我们能检测到更多突变类型。
4.３’－错配聚合酶链式反应（3’－mismatch PCR）：原理是在PCR扩增反应中，使用特异性引物（如C1a18，C1a3），由于3’末端错配导致扩增产物减少，产生片段基因，从而区分突变型与野生型。上述几种分子生物学技术主要用来检测Hp23SrRNA2142/2143位点A-G基因突变，然而，有文献报道在一些地区A2142C也是比较常见的突变类型，选择3’－mismatch PCR技术可以对A2142C位点突变进行特异性检测。
５．肽核酸－荧光原位杂交（PNA-FISH）：原理是用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将探针直接与完整细胞内的目标序列原位杂交，再用与荧光素分子耦联的单克隆抗体与探针分子特异性结合，最后利用荧光显微镜便可检测到与荧光探针互补的核酸序列。FISH较PCR相比，不需要大量待测核酸，检测方法更为准确、迅速。PNA-FISH技术中应用的是PNA探针，相比传统的DNA探针，它能更好地与目标基因杂交，适宜长度（15bp）较短，且没有静电排斥。目前，已有众多研究利用该技术检测到Hp对克拉霉素耐药性，且获得高敏感度及特异度。该方法虽然快速、准确，但不能检测除克拉霉素以外其他抗生素的耐药性，且具有侵入性，不适合儿童和老人。
6.基因芯片：也被称为DNA微阵列，原理是将许多特定的DNA片段有规律地固定在支持物上，再与荧光探针标记的待测序列杂交，然后通过荧光检测系统对芯片扫描后进行检测分析，从而获得定性、定量的结果。该技术能同时检测多种抗生素、多种基因、多位点突变，但高昂的费用使其在临床应用中略显不足。目前在姚雪的文章中建立了一种可同时检测Hp克拉霉素、喹诺酮耐药位点的可视化基因芯片检测方法，其准确性与测序技术相当，不仅快速、敏感，而且大大降低了成本，为我们接下来的研究设计提供了借鉴和指导。
7.DNA测序：作为分子生物学检测方法中的“金标准”，目前该技术：
（１）用来验证其他检测方法的可靠性
（２）发现新的其他未知突变。随着高通量
测序技术的快速发展，DNA测序技术变得更为直接、准确，可进行多耐药突变检测。该技术虽然准确可靠，但是因测序仪器昂贵、模板浓度不当、引物设计不合理等原因，目前多应用于科研单位或专业测序公司。
结论
马斯特里赫特Ⅳ－佛罗伦萨共识报告指出，当Hp对克拉霉素的耐药率达到或超过15%~20%时，选择克拉霉素治疗Hp前应先行耐药性检测。目前，我国Hp对克拉霉素耐药率高，掌握Hp耐药状况对选择正确的治疗方案具有重要意义，而不管是传统药敏－培养试验还是最新的分子生物学方法都尚未在临床得到推广。传统方法因其费时、费力等缺点已不考虑纳入临床诊断，分子生物学检测方法因其专一、快速、敏感成为我们研究的重点。在Hp对克拉霉素耐药性分子生物学检测方法研究中，针对23SrRNA基因突变，主要应用PCR技术，其中最被看好的是RT—PCR方法，其解决了PCR易污染问题，可以检测胃黏膜、粪便和唾液等标本，目前已经越来越多的应用于科研及临床诊断中。
来源：胡美莲，高阳，李晓露等. 幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性检测研究进展.中国实验诊断学. 2018, 22(8): 1474-1476.
作者：胡美莲，高阳，李晓露，王丽波 吉林大学第一医院小儿消化科
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