新型生物标志物在炎症性肠病精准诊疗中的应用及展望
炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是病因不明的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn disease, CD)。除此之外，尚有近5%～15%的IBD患者难以鉴别，被称为IBD类型待定( inflammatory bowel disease unclassified，IBDU)和未定型结肠炎(indeterminate colitis，IC)。这些患者中约80%可在后期发展至UC或CD。IBD诊断缺乏金标准，且病程长、易反复发作，需要长期维持用药，治愈十分困难，IBD个体化或精准诊疗是目前IBD临床管理发展的新方向。
血清等体液中生物标志物具有检测方便、无创、重复性好等特性，生物标志物的检测将在IBD精准诊疗的以下几个关键环节发挥重要作用：
(1) IBD的诊断和鉴别诊断
(2)疾病活动性、严重程度及并发症的判定
(3)治疗方案的选择及治疗效果的预测。
IBD的发病与免疫反应异常、肠道微生物菌群失调、遗传和环境改变有关。基于微生物抗原或自身抗原的血清自身抗体，IBD发病相关的基因、细胞因子、调节因子等可以用作预测病程、并发症和对药物、手术反应的生物学指标。除了临床常用的传统血清学标志物如ANCA、ASCA抗体及粪便钙卫蛋白外，遗传易感标志物、miRNAs、代谢物等新型标志物在IBD患者个体化精准评估管理中的应用前景、存在的问题和发展方向也值得加强重视。
遗传易感标志物
遗传易感标志物(基因)检测可以识别遗传缺陷，早期预测和发现炎症性肠病，指导临床用药，尤其在儿童IBD(PIBD)中发挥重要作用。通过全基因组关联研究(GWAS)已经确定了200多个IBD易感位点，这些位点与IBD疾病发生的相关途径(如先天免疫、自噬和肠道屏障功能等)密切相关，且部分易感位点已经过进一步的临床和实验证实。
(一)CD遗传易感基因
NOD2/CARD15是第一个发现的CD易感基因，西方CD人群最常见的突变体Arg702Trp，Gly908Arg和1007fsCins，其编码的氨基酸在第702、908的点突变以及1007位的移码突变，使CD发生的相对危险性分别上升14.3、34.1和17.6倍，然而这些突变与亚洲人群的发病无关。此外，NOD2基因型被认为是CD回肠病变、纤维化狭窄及渗透性病变的独立预测因子。基于NOD2基因型的风险评估已被用来预测CD手术风险，以及区分回肠和结肠病变。最新报道的几种NOD2突变体与亚洲人群CD发病有关，主要包括与马来西亚人群常见的JW1突变，以及中国和印度人群常见的P268S。其中P268S已被证实与我国汉族、壮族、土族等人群的CD易感性有关。进一步的表现型-基因型分析显示，P268S与我国CD患者发病年龄早，回肠受累和狭窄性病变密切相关。
IL-23途径组成成分(如IL23R, IL12B, STAB, JAK2和TYK2等)都是IBD常见易感基因。其中IL23受体基因IL23R中的几种常见突变(Gly149Arg，Val362Ile和Arg381Gln)与CD的易感性明显相关，但该相关性具有种族差异，其中突变体Gly149Arg在汉族人群中最为常见。另外IL-23R基因型与CD纤维化狭窄密切相关。
近期，Ellinghaus等发现两个易感基因PRDM1和NDP52突变，在CD患者中较为特异。两者参与机体的免疫调节即细胞内自噬，从而影响IBD的病理进程。此外，ATG16L1也是CD的常见易感基因。ATG16L1中的Thr300Ala突变体(rs2241880)能增加caspase-3介导的ATG16L1降解，促使机体在长期凋亡刺激的情况下发生自噬缺陷。然而该突变与东亚人群的CD无明显相关性。在T淋巴细胞免疫应答上，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)发挥重要作用，其84bp的AT异常重复直接影响我国中部地区汉族人群CD的发病率。
(二)UC遗传易感基因
与UC相关的易感基因，主要包括参与肠道屏障功能的易感基因(如HNF4A，LAMB1，CDH1和GNA12)及人类白细胞抗原(主要是HLA-II类等位基因)。HLA-DR2与UC密切相关，UC患者中HLA-DRB1*0103, HLA-B27和HLA-B58等位基因，以及CD患者中HLA-A2, HLA-DR1和HLA-DQw5等位基因分别与肠道外表现相关。经典的HLA基因可解释3%CD和6%UC中的基因突变。非经典的Ⅰ类基因如MIC基因也与UC有关，其中MICA-A5.1和MICB-CA18及MICB0106与中国UC的发病有相关性。肿瘤坏死因子TNF-308G/A在意大利患者中，与UC和CD显著相关，而在我国人群中，仅与UC发病的易感性有关，与CD无关。另外，Lv等发现IL23R突变体IL23R-rs11805303和PTPN2突变体PTPN2-rs2542151与我国汉族人群UC的易感性密切相关。
(三)IBD遗传易感基因在疗效判断
以及指导用药方面的作用
通过遗传易感基因也可指导IBD用药以及预测药物反应。例如，针对IL23途径的新型药物优特可诺，以及针对SMAD7的反义寡核苷酸Mongersen，都展示了良好的治疗前景。肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体英夫利昔(infliximab)常用来治疗重症CD和UC以及CD瘘管患者，发生IL23R纯合突变的IBD患者对抗TNF治疗的反应性更好。
硫唑嘌呤(AZA)是炎症性肠病一线免疫抑制剂，也是维持用药的主要药物。小部分患者服用AZA后易并发胰腺炎，Mirkov等确定了单倍型HLA-DQA1*02：01，HLA-DRB1*07：01与AZA诱导的胰腺炎的相关性，有利于降低药物副反应。
随着新一代高通量测序技术的发展，IBD遗传易感标志物具有非常良好的应用前景。如何将现有的遗传信息转化为临床应用是目前面临的一大挑战。IBD属多基因遗传疾病，极易受环境因素和种族因素影响，因此现有证据并不支持基因诊断在临床的单独应用。但与临床指征、血液学和微生物学指标相结合，将成为IBD诊断和治疗的未来发展方向。
miRNA标志物
miRNA是一类长度为19～23个核苷酸的单链内源性小分子RNA，参与多种细胞生物学功能如免疫调节，细胞生长、凋亡，也参与一些疾病的发生发展。在UC和CD患者肠活检组织、血清、外周血和唾液中均发现有独特的miRNA表达谱(表1)。
表1 IBD患者血清、体液和组织中miRNA表达变化
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疾病类型 | 规模 | 样本 | 表达 | miRNA | 作者及文献 | 应用前景 |
IBD患者vs.健康对照 | Spain, 36 vs.35 | 血清 | 上调 | miR-127-3p, miR-491-5p, miR-18a, miR-145, let-7b, miR-185, miR-29c, miR-19b, miR-20b, miR-106a, miR-17, miR-222 | Iborra[20] | IBD的诊断 |
下调 | miR-135 | |||||
UC患者vs.健康对照 | USA, 5 vs. 5 | 唾液 | 上调 | miR-21, miR-31, miR142-3p | Schaefer[17] | UC的诊断和鉴别诊断 |
USA, 20 vs. 20 | 外周血血小板源miRNA | 上调 | miR1885p, miR378, miR422a, miR500, miR5015p, miR-7695p, miR874Duttagupta[18] | |||
Greece, 88vs. 162 | 外周血 | 上调 | miR-16, miR-21, miR-28-5p, miR-151-5p, miR-155, miR-199a-5p | Paraskevi[19] | ||
USA, n＝62 | 肠道黏膜组织 | 上调 | miR-16, miR-21, miR-23a, miR-24, miR-29A, miR-126, miR-195, let-7f | Wu[23] | ||
下调 | miR-192, miR-375, miR-422B | |||||
UC活动期vs.非活动期 | USA, 24 vs. 22 | 血清 | 上调 | miR-223-3p, miR-4454, miR23a-3p, miR320e | Polytarchou[24] | 与UC患者疾病活动程度密切相关，可用于疾病活动度的判断 |
Spain aUC：9iUC：9aCD：9iCD：9 | 肠道黏膜组织 | 上调 | miR548a3p , miR650 | Iborra[20] | ||
下调 | miR196b, miR489, miR630 | |||||
CD患者vs.健康对照 | USA, 5 vs. 5 | 唾液 | 上调 | miR-26a, miR-101 | Schaefer[17] | CD的诊断和鉴别诊断 |
Greece, 128vs. 162 | 外周血 | 上调 | miR-16, miR-23a, miR-29a, miR-106a, miR-107, miR-126, miR-191, miR-199a-5p, miR-200c, miR-362-3p, miR-532-3p | Paraskevi[19] | ||
USA, 46 vs. 32 | 儿童CD患者血清 | 上调 | miR-16, let-7b, miR-195, miR-106A, miR-20a, miR-30E, miR-140, miR-484, miR-93, miR-192, miR-21 | Zahm[21] | ||
France, 8 vs. 10 | 肠道黏膜组织 | 上调 | miR-9, miR-21, miR-22, miR-26a, miR-29b, miR-29C, miR-30b, miR-31, miR-34C-5P, miR-106A, miR-126, miR-126, miR-127-3p, miR-130A，miR-146a, miR-146B-5P, miR-150, miR-155, miR-181C, miR-196A, miR-324-3p, miR-375 | Fasseu[22] | ||
USA, n＝62 | 回肠末端黏膜组织 | 上调 | miR-22, miR-31, miR-215 | Wu[23] | 判断回结肠受累情况 | |
下调 | miR-19B | |||||
结肠黏膜组织 | 上调 | miR-23a, miR-26a, miR-126, miR-320, miR-422B, let-7d | ||||
CD活动期vs.非活动期 | Spain, aUC：9 iUC：9aCD：9iCD：9 | 血清 | 上调 | miR1885p , miR-877 | Iborra[20] | 与CD患者疾病活动程度密切相关，可用于疾病活动度的判断 |
下调 | miR18a, miR128, miR1405p, miR-145 | |||||
肠道黏膜组织 | 上调 | miR18a, miR1403p, miR629, let7b | ||||
下调 | miR328, miR422a, miR8555p |
(一)miRNA与IBD的诊断和鉴别诊断
Schaefer等报道了唾液miR-21、miR-31及miR142-3p在UC患者中表达增高；而miR-26a和miR-101在CD患者中表达增高，因此可作为IBD的诊断和鉴别诊断。
Duttagupta等抽提外周血单核细胞、血小板、微泡的miRNA,发现miR188-5p等7种血小板源的miRNA在UC患者中明显上调。Paraskevi等发现miR-16等6个miRNAs在UC外周血中表达升高，miR-16、miR-23a等11个miRNAs在CD外周血中表达升高。
Iborra等在UC和CD患者血清中发现12个miRNAs普遍升高，而miR-135表达明显降低。Zahm等在儿童CD患者血清中鉴定出miR-16、let-7b等11个特异的miRNA，其CD诊断敏感度可达70%～83%，特异度可达75%～100%。
另外，miRNA的表达有组织特异性，测定肠活检组织miRNA的差异表达，也可用于IBD的诊断和鉴别诊断，还将有助于判定IBD回结肠受累情况。
(二)miRNA与IBD疾病活动度的判断
UC和CD患者中，处于疾病活动期、缓解期和复发期的miRNA表达水平明显不同。Iborra等发现相对于非活动期患者，活动期UC患者的肠黏膜中miR548a3p和miR650明显升高，而miR196b、miR489和miR630表达明显下降；活动期CD患者，其肠黏膜miR18a、miR1403p等明显升高，而miR328、miR422a和miR8555p明显下降。CD患者血清中miR1885p和miR877表达增高，而miR18a、miR128等表达下降。Polytarchou等发现血清miR-223-3p、miR-4454、miR23a-3p和miR320e水平与UC患者疾病活动程度的相关性甚至优于血清CRP。另外多种miRNA如miR-21、miR-31并不是IBD的特异指标，但随着IBD病情加重而逐渐升高，并且可在正常或慢性炎症组织中准确的识别肿瘤发生。
(三)miRNA在IBD疗效判断及指导
用药方面的作用
miRNA在预测IBD治疗效果方面展现出巨大潜能，患者糖皮质激素治疗前后miRNA表达水平改变明显。接受英夫利昔单抗诱导治疗的患者的血清中，miRNA let-7D和let-7e的miRNA水平分别显著增加。另外多种miRNAs，如miR-21、miR-146、miR-19b和miR-210等，不仅可被用于诊断，还能预测预后，并且可能是治疗的靶点。
miRNA在IBD的诊断的价值尚需大规模的临床验证，研究miRNA在IBD发病机制中的作用特别是miRNA如何调节免疫平衡，肠道上皮细胞屏障，自噬抑制将促进miRNA对IBD的诊断、预后及治疗的临床应用潜力。
代谢组学标志物
代谢组学是对生物样本中小分子代谢物的研究。已有多项研究报道，IBD患者和健康对照组之间，以及在CD和UC之间，代谢物谱有明显差异，其中包括氨基酸、TCA循环中间体和脂肪酸以及嘌呤代谢产物，因此这些代谢物有助于UC和CD的鉴别诊断，且氨基酸的代谢和疾病活动之间可能存在相关性。
肠道菌群的变化可以改变IBD的代谢物谱，并在尿液中体现，如在IBD的患者中，尿液中马尿酸的水平显著下降，低水平的马尿酸能有效区分IBD患者和健康人群。因此，尿液中代谢物的测定有望成为新一代的IBD无创、敏感的生物标志物。
呼吸代谢组学将进一步推动了代谢组学在IBD诊断领域研究中的应用。Dryahina等发现，IBD患者呼气戊烷水平升高，尤其在CD患者中表现更明显，而NO在UC患者中表现更明显。
问题与展望
IBD诊断和治疗面临诸多难题，未来IBD临床管理模式趋向于个体化医疗，临床对实验室生物标记物寄予了很大期望，但现阶段的生物标志物远远不能满足临床需要，除了判断活动度的标志物外几乎没有标志物纳入到IBD的临床诊疗指南中。
1．鉴于我国IBD人群血清学标志物与西方存在敏感性的差异，提示东西方IBD发病机制之间可能存在不同，这提示我们应该着眼于揭示中国疾患者群的发病机制以及中国人群的临床特点，开发适应本国人群的IBD标志物，服务于中国疾病人群的个体化管理。
2．IBD相关的免疫学、微生物、遗传学、表观遗传学和代谢组学的研究有助于新兴标志物的发现，如细胞因子，不同亚型的免疫细胞等。
3．未来高通量测序技术的发展，多种生物库项目的建立将促使IBD信息快速产生和累积，通过大数据的分析和处理，可以做到对个人电子病历的实时监控；新诊断的IBD患者可根据其遗传、微生物和免疫谱测定的综合分析，针对性的选择合适的治疗方案，达到真正的精准医疗。
4．IBD生物标志物在与临床表型、治疗、预后关系方面研究仍有限。我们需要成立了以多学科协作为基础的IBD临床中心，建立多中心的大规模、标准化的临床研究、多种诊断和药物比较的临床研究等，提高生物标志物对IBD的诊断与鉴别诊断水平，并在疾病活动性、严重程度及并发症的判定以及治疗效果的预测，临床治疗方案的选择中发挥更多作用。
作者：卢洁 谢鑫友 张钧 来源：中华医学网
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